細(xì)胞計(jì)數(shù)是確定培養(yǎng)中鋪板的細(xì)胞濃度、確定細(xì)胞活力和評估細(xì)胞分離程序結(jié)果的一個(gè)組成部分。建議在細(xì)胞分離之前進(jìn)行初始細(xì)胞計(jì)數(shù)；然后可以將該數(shù)字與細(xì)胞分離后的細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行比較，以計(jì)算細(xì)胞恢復(fù)率。此外，當(dāng)預(yù)期細(xì)胞活力可能會降低時(shí)，應(yīng)進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，例如，在處理冷凍保存的細(xì)胞或離體操作的細(xì)胞時(shí)。

    可以使用臺盼藍(lán)或3% 乙酸和亞甲藍(lán)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù). 進(jìn)行總有核細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，建議使用 3% 乙酸和亞-CH3藍(lán)。乙酸溶解細(xì)胞膜，亞甲藍(lán)染色暴露的細(xì)胞核。由于成熟的紅細(xì)胞缺乏細(xì)胞核，因此在計(jì)數(shù)時(shí)被排除在外。或者，建議使用臺盼藍(lán)來計(jì)數(shù)活的哺乳動物細(xì)胞。臺盼藍(lán)穿透細(xì)胞膜，因此它進(jìn)入細(xì)胞膜受損的細(xì)胞（死細(xì)胞）的細(xì)胞質(zhì)，將它們?nèi)境伤{(lán)色。活細(xì)胞保持完整，可以通過排除藍(lán)色染料的能力與死細(xì)胞區(qū)分開來。在這種情況下，人們將計(jì)算完整的活細(xì)胞。

   本文描述了如何使用 3% 乙酸和亞-CH3藍(lán)進(jìn)行總有核細(xì)胞計(jì)數(shù)，以及如何通過臺盼藍(lán)染料排除進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。

材料準(zhǔn)備：

3% 乙酸和亞-CH3藍(lán)（或臺盼藍(lán)

96 孔板（例如 Corning® 96 孔圓底微孔板，貨號 #38018）或微量離心管（例如 Costar® 微量離心管，貨號#38090）

血細(xì)胞計(jì)數(shù)器（血細(xì)胞計(jì)數(shù)板）和蓋玻片

70% C2H6O

移液器（例如瑞寧移液器）

實(shí)驗(yàn)步驟和方法：

第一部分：樣品制備

選項(xiàng) 1：用 3% 乙酸和亞-CH3藍(lán)對總有核細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行細(xì)胞稀釋

  使用磷酸鹽緩沖鹽水或無血清培養(yǎng)基對充分混合的單細(xì)胞懸浮液進(jìn)行適當(dāng)稀釋。為了準(zhǔn)確表示濃度，請使用至少 20 μL 的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行稀釋。

示例：制備 10 倍稀釋液

在微量離心管或 96 孔板的孔中加入 180 μL 的 3% 乙酸和亞-CH3藍(lán)。混合細(xì)胞懸浮液，將 20 μL 添加到含有 3% 乙酸和亞-CH3藍(lán)的試管或孔中。

選項(xiàng) 2：通過臺盼藍(lán)染料排除對活細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行細(xì)胞稀釋

 確保要計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液*重新懸浮。在細(xì)胞沉降之前，將適量的細(xì)胞懸液 (20-200 μL) 放入離心管中。加入等體積的 0.4% 臺盼藍(lán)并輕輕混合。將混合物在室溫 (15°C – 25°C) 下孵育 5 分鐘。

第二部分：使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)

   通過用 70% C2H6O清潔腔室表面來制備血細(xì)胞計(jì)數(shù)器。擦干。將蓋玻片放在腔室上。

 使用 20 μL 移液器重新懸浮細(xì)胞混合物，并將 10 μL 的染色細(xì)胞放入血細(xì)胞計(jì)室。

注意：小心不要移動蓋玻片。允許毛細(xì)作用將樣品吸入。

 將血細(xì)胞計(jì)數(shù)器放在雙目光學(xué)顯微鏡的載物臺上。將顯微鏡調(diào)整到 10 倍放大倍率并聚焦在細(xì)胞上。

 使用手動計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)器，計(jì)算血細(xì)胞計(jì)數(shù)器四個(gè)外部正方形中的每一個(gè)中的細(xì)胞（染色的細(xì)胞核）（圖 1A），包括位于底部和左側(cè)周邊的細(xì)胞，但不包括位于頂部和右手邊（圖 1B）。如果在第一部分中使用了 3% 乙酸和亞-CH3藍(lán)，則計(jì)算染色的細(xì)胞核。如果在第一部分中使用了臺盼藍(lán)，則計(jì)算未染色的活細(xì)胞。

圖 1.血細(xì)胞計(jì)數(shù)器網(wǎng)格線

血細(xì)胞計(jì)數(shù)器圖指示（A）四組紅色和（B）其中一組應(yīng)用于計(jì)數(shù)的 16 個(gè)方塊。

注意： 適當(dāng)?shù)南♂屜禂?shù)將取決于起始樣本中存在的大致細(xì)胞數(shù)量，但應(yīng)使血細(xì)胞計(jì)數(shù)器中的細(xì)胞濃度為每平方（即大或主要正方形）50-100 個(gè)細(xì)胞。如果血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上每個(gè)主要正方形的細(xì)胞多于或少于大約 100 個(gè)，請使用更大或更小的稀釋因子制備新的稀釋樣品。

     血細(xì)胞計(jì)數(shù)器的九個(gè)主要方塊中的每一個(gè)都代表 0.1 mm 3的總體積。由于 1 cm 3相當(dāng)于 1 mL，因此可以使用以下等式確定細(xì)胞濃度：

有核細(xì)胞總數(shù)/mL = 每平方平均細(xì)胞數(shù) x 稀釋因子 x 10 4

示例：如果四個(gè)外部方塊中的每一個(gè)的細(xì)胞計(jì)數(shù)在 100 稀釋因子下分別為 21、15、20 和 17，則平均細(xì)胞計(jì)數(shù)將為 (21 + 15 + 20 + 17) ÷ 4 = 18.25。

因此，原始懸浮液中細(xì)胞的總濃度為：18.25 x 100 x 10^4 = 18,250,000 個(gè)細(xì)胞/mL。

使用人工的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法誤差率較高，為提高細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確度和細(xì)胞計(jì)數(shù)效率可以使用全自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。博大博聚旗下的全自動細(xì)胞細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系列，具有多種規(guī)格供選擇，可以滿足不同的用戶需求。

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