實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行無(wú)乳鏈球菌血清分型的實(shí)驗(yàn)步驟

B組鏈球菌(GBS) 是一種熒光檢測(cè)帶有包膜的革蘭氏陽(yáng)性菌，是新生兒侵襲性感染敗血癥和腦膜炎的重要原因，GBS血清抗體傳統(tǒng)分型法通常需要經(jīng)過(guò)乳膠凝集、多重 PCR 和條帶大小分析或全基因組序列分析等步驟，過(guò)程繁瑣，技術(shù)成本昂貴，所以在PCR實(shí)驗(yàn)室中采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法進(jìn)行血清分型不僅可以替代乳膠凝集法，還可以改進(jìn) GBS 血清型數(shù)據(jù)的采集。



GBS 細(xì)菌菌株分離與培養(yǎng)
將GBS 分離株在胰蛋白酶大豆 (TS) 或 5% 羊血瓊脂平板上于37°C 培養(yǎng)，然后在 TS 培養(yǎng)基中于 37°C 培養(yǎng)過(guò)夜。

通過(guò)乳膠凝集進(jìn)行血清分型
根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用 Immulex Latex Agglutination Streptococcus B 試劑盒（Staten Serum Institute；Copenhagen，Denmark）通過(guò)乳膠凝集對(duì)所有 GBS 分離株進(jìn)行血清分型。簡(jiǎn)而言之，將 10 μl 乳膠試劑添加到懸浮在 10 μl 鹽水中的單個(gè) GBS 菌落中。如果 30 秒后可見(jiàn)凝集，則旋轉(zhuǎn)反應(yīng)并解釋為陽(yáng)性。 

實(shí)時(shí)熒光定量法 PCR 進(jìn)行血清分型
設(shè)計(jì)引物和探針以擴(kuò)增無(wú)乳鏈球菌每種血清型的多糖莢膜基因的區(qū)別區(qū)域。引物中的寡核苷酸未經(jīng)修飾和脫鹽，探針用熒光探針（5' 6-羧基熒光素 (6-FAM)）和兩種猝滅劑標(biāo)記，并通過(guò)高壓液相色譜法純化.

PCR實(shí)時(shí)熒光定量分析
使用 Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit 從 GBS 的過(guò)夜培養(yǎng)物中提取基因組 DNA。PCR 反應(yīng)最終體積為 20 μl，由 10 μl Taqman Universal Mastermix、7.4 μl 無(wú)菌水、0.2 μl 正向引物（100 μM 原液）、0.2 μl 反向引物（100 μM 原液）、0.2 μl 探針（100 μM 儲(chǔ)備液）和 2 μl GBS DNA（25 ng/μl）。在 熒光定量PCR儀器上進(jìn)行三次反應(yīng)，并進(jìn)行軟件分析。反應(yīng)參數(shù)如下： 50°C 初始孵育 2 分鐘；在 95 °C 下初始變性 10 分鐘；在 95 °C 15 秒和 60 °C 1 分鐘下進(jìn)行 35 個(gè) PCR 循環(huán)。陽(yáng)性反應(yīng)定義為循環(huán)閾值（CT ) < 30 對(duì)于 50 ng DNA 模板/反應(yīng)。每次運(yùn)行都包含陰性對(duì)照反應(yīng)（無(wú) DNA 模板）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與乳膠凝集進(jìn)行比較。通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 方案檢測(cè)到預(yù)測(cè)序列，并且與任何其他血清型引物/探針組合沒(méi)有陽(yáng)性反應(yīng)。而后通過(guò)乳膠凝法集確認(rèn)了 47 株菌株的血清型，由此驗(yàn)證基于 PCR 的方法和乳膠凝集方法的血清分型結(jié)果無(wú)差異。
 實(shí)驗(yàn)方法對(duì)比
我們知道用于 GBS 血清分型技術(shù)的基于非核酸的實(shí)驗(yàn)室方法成本較高，并且需要高滴度的血清型特異性抗血清，并且會(huì)阻礙 GBS 血清型流行率的研究。而乳膠凝集試劑盒可若用于實(shí)驗(yàn)室的 GBS 血清分型，其價(jià)格也較貴。通過(guò)分子莢膜分型技術(shù)，包括多重 PCR   全基因組序列的靶向分析新可用的序列信息的適應(yīng)性和相對(duì)容易的性能，但僅能分血清型 Ia、Ib 和 III 三種血清型。

   與許多現(xiàn)有方法不同，實(shí)時(shí) PCR 法的血清分型不是基于操作員對(duì)生化反應(yīng)的解釋?zhuān)试S特異性鑒定 GBS 血清型，盡管會(huì)受到其他細(xì)菌 DNA 的干擾，但它可能在流行病學(xué)研究的背景下比較有用，作為現(xiàn)有多重 PCR 檢測(cè)的替代方法。隨著進(jìn)一步的發(fā)展，這種新方法可以直接從標(biāo)本中檢測(cè) GBS 血清型，而無(wú)需培養(yǎng)。這種方法基于實(shí)時(shí) PCR 的血清分型雖然便捷，但檢測(cè)由于需要特定的引物-探針組所以暫時(shí)無(wú)法直接識(shí)別新的血清型。

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