cDNA合成是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的基礎(chǔ)技術(shù)，它將RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA，廣泛應(yīng)用于基因克隆、表達(dá)分析等領(lǐng)域。本文將詳細(xì)介紹cDNA合成的原理、方法及操作流程，幫助研究人員掌握這一關(guān)鍵技術(shù)。

cDNA合成的基本原理

cDNA即互補(bǔ)DNA，是指以信使RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成的DNA鏈。cDNA合成包括第一鏈合成和第二鏈合成兩個(gè)關(guān)鍵步驟。

第一鏈合成

第一鏈合成使用逆轉(zhuǎn)錄酶，以RNA為模板合成互補(bǔ)DNA鏈。常用的逆轉(zhuǎn)錄酶包括M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，其中M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的RNase H缺失突變株能合成更長(zhǎng)的cDNA。

引物選擇是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，主要分為三類：

Oligo(dT)引物：特異性結(jié)合mRNA的poly(A)尾，對(duì)mRNA有高度特異性

隨機(jī)六聚體引物：適用于所有RNA模板，尤其適合含有使反轉(zhuǎn)錄酶終止序列的mRNA

序列特異性引物：僅產(chǎn)生目標(biāo)cDNA，導(dǎo)致更特異的PCR擴(kuò)增

第二鏈合成

第二鏈合成主要有兩種方法：

自身引導(dǎo)法：合成的單鏈cDNA 3'端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，作為合成第二鏈的引物。但該方法不易控制，且用S1核酸酶切割發(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí)易導(dǎo)致mRNA 5'端序列缺失和重排。

置換合成法：利用RNase H在DNA-RNA雜交鏈的mRNA上造成切口和缺口，產(chǎn)生RNA引物，再在大腸桿菌DNA聚合酶I作用下合成第二鏈。該方法非常有效，可直接利用第一鏈反應(yīng)產(chǎn)物，無需進(jìn)一步處理和純化，且不必使用S1核酸酶。

Riboclone M-MLV(H-) cDNA合成技術(shù)詳解

系統(tǒng)組成

該系統(tǒng)的試劑包括：

特異性引物

M-MLV第一鏈緩沖液(5×)

rRNasin RNA酶抑制劑

M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，RNase H-

對(duì)照RNA

M-MLV第二鏈緩沖液(10×)

RNase H

DNA聚合酶Ⅰ

T4 DNA聚合酶Ⅰ

不含核酸酶的水

操作步驟

第一鏈合成

在無菌無RNA酶的離心管中加入RNA模板和適當(dāng)引物（每μg RNA使用0.5μg引物），用H?O調(diào)整體積至15μl。

70℃處理5分鐘，冷卻至室溫，離心。

依次加入5×第一鏈緩沖液5μl、rRNasin RNA酶抑制劑25U、M-MLV(H-)反轉(zhuǎn)錄酶200U，用H?O調(diào)至總體積25μl。

輕輕混勻，取出5μl至另一管中加入[α-32P] dCTP，用于同位素?fù)饺敕派湫曰钚詼y(cè)定。

37℃（隨機(jī)引物）或42℃（其他引物）溫浴1小時(shí)。

第二鏈合成

取第一鏈反應(yīng)液20μl，依次加入10×第二鏈緩沖液20μl、DNA聚合酶Ⅰ23U、RNase H 0.8U，加H?O至終體積100μl。

輕輕混勻，如需進(jìn)行第二鏈同位素?fù)饺霚y(cè)定，可取出10μl加入[α-32P] dCTP。

14℃溫浴2小時(shí)（如需合成長(zhǎng)于3kb的cDNA，則需延長(zhǎng)至3-4小時(shí)）。

70℃處理10分鐘，低速離心后置冰上。

加入2U T4 DNA聚合酶，37℃溫浴10分鐘。

加入10μl 200mmol/L EDTA終止反應(yīng)。

用等體積酚:氯仿抽提，乙醇沉淀，干燥后溶于TE緩沖液。

合成產(chǎn)物定量分析

通過同位素?fù)饺敕派湫曰钚詼y(cè)定，可以計(jì)算cDNA合成量：

第一鏈產(chǎn)量測(cè)定：

第一鏈摻入率(%) = 摻入cpm/總cpm × 100%

摻入dNTP量(nmol) = 2 nmol dNTP/μl × 反應(yīng)體積(μl) × 第一鏈摻入率

合成cDNA量(ng) = 摻入dNTP (nmol) × 330 ng/nmol

mRNA向cDNA轉(zhuǎn)變率 = 合成cDNA量(ng) / 模板RNA量(ng) × 100%

第二鏈產(chǎn)量計(jì)算：

第二鏈摻入率 = 摻入放射性活性/總放射性活性

摻入dNTP量(nmol) = [0.4 nmol dNTP/μl × 反應(yīng)體積(μl) - 第一鏈摻入nmol] × 第二鏈摻入率

第二鏈cDNA合成量(ng) = nmol dNTP × 330 ng/nmol

雙鏈cDNA轉(zhuǎn)變率 = 雙鏈cDNA合成量(ng) / 單鏈cDNA合成量(ng)

一般cDNA第一鏈轉(zhuǎn)變率和雙鏈轉(zhuǎn)變率以12-50%和50-200%為好。

cDNA合成技術(shù)的創(chuàng)新進(jìn)展

新型DNA合成技術(shù)

近年來，DNA合成技術(shù)不斷創(chuàng)新。華大生命科學(xué)研究院研發(fā)的基于并行原理的DNA合成技術(shù)（mMPS）采用"微芯片"創(chuàng)新范式，在合成通量、產(chǎn)量和質(zhì)量上實(shí)現(xiàn)了系統(tǒng)性突破。該技術(shù)將芯片分為獨(dú)立的毫米級(jí)微芯片，每個(gè)微芯片上僅合成一條短鏈DNA，且表面帶有專屬識(shí)別碼，可對(duì)DNA片段進(jìn)行身份識(shí)別與分選。

環(huán)狀RNA合成技術(shù)

國(guó)家衛(wèi)生研究院開發(fā)出一種新型環(huán)狀RNA合成法，利用連接酶核酶將線性RNA環(huán)化，生成環(huán)狀RNA。這種環(huán)狀RNA具有較高的穩(wěn)定性，對(duì)核酸外切酶的降解有更強(qiáng)的抵抗力，明顯延長(zhǎng)了RNA的作用時(shí)間，同時(shí)降低了RNA的使用劑量。

AI技術(shù)在DNA設(shè)計(jì)中的應(yīng)用

科學(xué)家們現(xiàn)在利用生成式人工智能設(shè)計(jì)合成DNA序列，作為"基因開關(guān)"控制哺乳動(dòng)物特定細(xì)胞中的基因表達(dá)。這種技術(shù)可根據(jù)特定需求，從零開始"創(chuàng)作"自然界中不存在的DNA片段，為基因治療提供了新的工具。

cDNA合成注意事項(xiàng)

RNA模板質(zhì)量：RNA的完整性對(duì)cDNA合成至關(guān)重要。需使用高質(zhì)量的無降解RNA，可通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)28S/18S rRNA條帶比例（比值≥1.5）評(píng)估RNA完整性。

RNase污染控制：在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中需使用無RNase污染的試劑和耗材，通常在合成第一鏈反應(yīng)體系中加入RNA酶抑制劑以抑制RNA酶活性。

引物選擇：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的引物。Oligo(dT)引物對(duì)mRNA有特異性，隨機(jī)引物適用于全轉(zhuǎn)錄組分析，序列特異性引物則用于特定基因的cDNA合成。

溫度條件：逆轉(zhuǎn)錄溫度對(duì)結(jié)果有顯著影響。使用隨機(jī)引物時(shí)通常在37℃進(jìn)行反應(yīng)，而使用其他引物時(shí)可在42℃進(jìn)行。

應(yīng)用領(lǐng)域

cDNA合成技術(shù)在多個(gè)領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用：

基因表達(dá)分析：通過逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析特定基因的表達(dá)水平。

病毒檢測(cè)：在臨床診斷中，cDNA合成是檢測(cè)RNA病毒（如新冠病毒）的關(guān)鍵步驟。

cDNA文庫(kù)構(gòu)建：用于研究細(xì)胞或組織在特定狀態(tài)下的基因表達(dá)譜。

基因克隆：克隆真核生物基因在原核系統(tǒng)中表達(dá)。

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