LightNing® EcoRI內(nèi)切酶組成

特性和用法

LightNing® EcoRI內(nèi)切酶，可在5~15 min內(nèi)完成反應(yīng)

u建議反應(yīng)條件

1× CutOne®緩沖液；

37℃溫育；

參照“DNA 快速酶切流程"配制反應(yīng)體系。

u失活條件

80℃溫育20 min。

u甲基化敏感性

對(duì)于被 CpG 對(duì)甲基化的 DNA，剪切可能受阻，

對(duì)于被 EcoBI 甲基化的 DNA，剪切可能受阻。

u儲(chǔ)運(yùn)條件

-20℃

相關(guān)問(wèn)答

Q:為什么在CutOne® Buffer中加入HSA？

A:一些酶在反應(yīng)過(guò)程中需要HSA的參與，我們?cè)?/span>CutOne® Buffer中添加了HSA，避免反應(yīng)中額外添加組分，使得酶切反應(yīng)更加便捷。

Q:HSA的添加對(duì)于雷霆系列限制性內(nèi)切酶的功能會(huì)產(chǎn)生什么樣的影響？

A:在我們的測(cè)試中未曾發(fā)現(xiàn)HSA對(duì)于雷霆系列限制性內(nèi)切酶的功能有任何影響。在有些情況下，對(duì)于部分的酶切反應(yīng)有促進(jìn)作用。

Q:我需要嚴(yán)格遵守5~15 min的酶切時(shí)間嗎？能夠延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間嗎？

A:雷霆系列限制性內(nèi)切酶經(jīng)過(guò)改造可以將酶切時(shí)間縮短至5~15 min。同樣也消除了限制性內(nèi)切酶的星活性（長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)造成的非特異性消化），在說(shuō)明書(shū)中告知的星活性出現(xiàn)的時(shí)間范圍內(nèi)可以適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間。

Q:我什么時(shí)候應(yīng)當(dāng)考慮星活性對(duì)于酶切反應(yīng)的影響？

A:如果額外的酶切條帶對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)產(chǎn)生影響時(shí)我們應(yīng)當(dāng)考慮星活性對(duì)于酶切反應(yīng)的影響。例如：進(jìn)行基因型、突變型分析或克隆時(shí)我們應(yīng)當(dāng)避免星活性的產(chǎn)生。避免星活性的有效方法：適當(dāng)擴(kuò)大反應(yīng)體積（較小的反應(yīng)體積容易造成甘油體積達(dá)到或超過(guò)總反應(yīng)體積的5%）；不進(jìn)行超長(zhǎng)時(shí)間孵育（過(guò)夜消化極易產(chǎn)生星活性）。

Q:有哪些關(guān)鍵因素會(huì)導(dǎo)致星活性？

A:長(zhǎng)時(shí)間孵育、過(guò)量的酶、高甘油含量（通常高于5%）、較小的反應(yīng)體系等因素都會(huì)導(dǎo)致星活性的產(chǎn)生。

Q:未經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物直接酶切要怎樣設(shè)定體系？

A:反應(yīng)體系推薦由這些內(nèi)容組成：10 μl PCR產(chǎn)物、2 μl 10×CutOneTM Buffer、1~2 μl相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶、ddH2O補(bǔ)齊到30 μl。酶的用量根據(jù)PCR產(chǎn)物的濃度而定，只加入2 μl反應(yīng)緩沖液的原因是PCR反應(yīng)中存在對(duì)應(yīng)的鹽離子和金屬離子，適當(dāng)減少反應(yīng)緩沖液的用量以保證最終反應(yīng)體系中的環(huán)境適宜限制性內(nèi)切酶發(fā)揮功能。

Q:限制性內(nèi)切酶簡(jiǎn)并性識(shí)別位點(diǎn)一定是回文的嗎？

A:大多數(shù)二型限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列是回文的，而且是特定的堿基序列。然而有些限制性內(nèi)切酶具有簡(jiǎn)并性識(shí)別位點(diǎn)，也就是說(shuō)識(shí)別位點(diǎn)中有一個(gè)或以上的堿基對(duì)是非特異的（例如：BsrfI識(shí)別5’RCCGGY, R=A/G, Y=C/T）。對(duì)于這樣的具有簡(jiǎn)并性識(shí)別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶，只要是符合要求的序列皆能被識(shí)別并且被正確地切割（例如5’ ACCGGC, 5’ ACCGGT, 5’ GCCGGC, 和5’ GCCGGT，其中兩個(gè)并不是回文的，仍然能被BsrFI識(shí)別并且切割）。